Zur Sammlung gehören europäische Gemälde der Spätgotik, der Renaissance, des Barock und des Klassizismus. Einen besonderen Schwerpunkt bildet die niederländische und flämische Malerei des 17. Jahrhunderts.

Die Ursprünge der Gemäldegalerie Alte Meister reichen zurück bis in das Jahr 1509, als Anna von Mecklenburg, Witwe von Landgraf Wilhelm II., Lucas Cranach d. Ä. mit einem kleinen Flügelaltar zum Gedächtnis an ihren verstorbenen Gemahl beauftragte. Die Periode der intensivsten Sammeltätigkeit war zwischen 1748 und 1756, als Landgraf Wilhelm VIII. ca. 800 Gemälde in Holland, Paris, Brüssel, Antwerpen, Venedig und in Deutschland durch seine Diplomaten und Kunstagenten ankaufen ließ. 1749-51 wurde für die Sammlung eine Galerie hinter das Palais des Landgrafen zwischen Auehang und Frankfurter Straße gebaut. 1877 zogen die Gemälde in das neu errichtete Gebäude der heutigen Neuen Galerie an der Schönen Aussicht um, wo sie bis zum Ausbruch des Zweiten Weltkriegs blieben. Die meisten Gemälde lagerten zwischen 1939 und 1945 im Reichsbahnbunker. Seit 1976 sind sie in den Etagen 1 bis 3 des Schlosses Wilhelmshöhe ausgestellt.